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熒光定量PCR（qPCR）介紹

      圖1：qPCR擴增曲線

  一般而言，熒光擴增曲線可以分為三個階段：熒光背景信號階段（基線期）、熒光信號指數擴增階段和平臺期。在熒光背景信號階段，擴增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋，無法判斷產物量的變化；在平臺期，擴增產物已不再呈指數級的增加，PCR的終產物量與起始模板量之間沒有線性關系，根據最終的PCR產物量也不能計算出起始DNA拷貝數；只有在熒光信號指數擴增階段，PCR產物量的對數值與起始模板量之間存在線性關系。

• 基線：實時熒光定量PCR反應的基線是指在PCR的最初幾個循環中（一般為3-15個循環）的信號水平。此階段的熒光信號變化量極小。低水平的基線信號相當于反應的背景或噪聲。每個實時熒光定量PCR反應的基線應通過用戶分析或擴增曲線自動分析，根據經驗確定。基線的設置，會影響到熒光閾值及Ct值。
• 熒光閾值：熒光閾值是在熒光擴增曲線上人為設定的一個值，它可以設定在熒光信號指數擴增階段任意位置上，一般熒光閾值默認是PCR 3-15個循環熒光信號標準偏差的10倍。
• Ct值：Ct值指的是PCR擴增過程中擴增產物的熒光信號達到設定的閾值時所經過的循環數。
• 標準曲線：標準曲線是標準物質的物理/化學屬性跟儀器響應之間的函數關系。對已知拷貝數的標準樣品做系列稀釋，對不同稀釋度的標準樣品進行熒光定量PCR并記錄Ct值，根據Ct值及拷貝數的對數繪制得到標準曲線，標準曲線的縱坐標代表起始拷貝數的對數，橫坐標代Ct值。

  利用實時熒光定量PCR對樣品的初始模板量進行定量分析，需要利用已知起始拷貝數的標準品作出標準曲線，再通過熒光定量PCR獲得未知樣品的Ct值，最后從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數。

             圖2：對初始模板進行定量分析

  標準品的制備: 設計特定引物，利用PCR對目的基因片段進行擴增，隨后將目的基因片段克隆至載體中，測序驗證是否為陽性重組質粒，最后收集陽性克隆質粒作為標準品。

   繪制標準曲線:測定質粒的濃度，依據公式計算出質粒的拷貝數。對質粒進行系列稀釋，分別作為模板進行熒光定量PCR并記錄Ct值。最后依據起始拷貝數的對數及Ct值繪制標準曲線，得到標準方程。當需要對起始模板進行定量時，只需要得到擴增曲線，讀得Ct值，帶入標準方程即可對起始模板定量。   

  實時熒光定量PCR熒光標記方法可分為熒光染料法和熒光探針法兩類。染料法是利用熒光染料可以嵌合到DNA雙鏈內部的特性，來指示擴增產物的增加。而探針法是利用與靶序列特異結合的熒光探針的信號積累來指示擴增產物的增加。

  熒光染料：染料法是利用熒光染料可以嵌合到DNA雙鏈內部的特性，來指示擴增產物的增加。現以最常用的SYBR GreenⅠ為例，介紹染料法熒光定量PCR的工作原理：

     圖3：熒光染料法原理

  SYBR GreenⅠ是一種熒光染料，可嵌合到雙鏈DNA的內部。在游離狀態下，SYBR Green Ⅰ發出微弱的熒光，但一旦與雙鏈DNA結合，其熒光增加1000倍。一個反應發出的全部熒光信號與出現的雙鏈DNA量呈正比，隨擴增產物的增加而增加，可通過熒光信號的積累來指示擴增產物的增加。

  熒光探針：探針為一段寡核苷酸，可與DNA序列特異性結合，一個模板結合一個探針。探針5'端具有報告基團（R），可發光；3'端有熒光淬滅基團（Q），能吸收光。探針完整時R基團所發射的熒光能量被Q基團吸收，PCR儀檢測不到熒光信號。隨著擴增的進行，探針會被聚合酶水解，報告基團發出的光沒有被淬滅基團吸收，從而被儀器檢測到。每擴增一條DNA鏈，釋放一個熒光信號，實現了熒光信號的累積與PCR產物形成完全同步。

      圖4：探針原理

探針法與染料法對比